从化学、药效和毒性角度比较认识正品大黄提取物

  土大黄与药典收载的正品大黄具有某些功效的相似性,常常被用作大黄替代品应用。究竟土大黄与正品大黄能否简单的替换使用,或者说两者之间有无差异,差异在何处?对此进行研究,对于正确认识土大黄,以及临床与市场上的正确应用等都具有重要意义。该文在作者己有的工作基础上,结合相关文献报道,以大黄的主要功效“泻下”为基本点,从化学、药效及其毒性等方面进行了探讨。分析结果表明,华北大黄(土大黄)的泻下作用弱于正品大黄,其原因在于两者间结合型蒽醌类成分的含量差异,同时华北大黄的小鼠急性毒性也强于正品大黄,因此,华北大黄不宜简单的替代正品大黄使用。

大黄提取物

  大黄是临床常用中药,具有明确的泻下作用。近年来的研究表明了大黄具有多种药理作用,临床也用于复合组方治疗多种病证。由于大黄的广泛应用,市场需求量不断地增大,在一些地方常常将当地生长的类似大黄药材替代大黄入药,所谓俗称“土大黄”。土大黄能否替代大黄入药,也曾有过研究报道。作者在己有工作的基础上,结合文献报道,对此进行了对比分析,以期对合理使用土大黄、以及准确使用大黄有所裨益。为了便于表述,这里的正品大黄是指2010年版《中国药典》收载的大黄[1]。本文实验工作所用的大黄为掌叶大黄Rheum palmatum L.。华北大黄R. franzenbachii Munt为地方药材,非药典所收载,将其作为“土大黄”进行对比研究。

  1.1 大黄泻下作用的结合型蒽醌与游离型蒽醌的关系 长期以来,蓼科大黄属(Polygonaceae Rheum)的多种植物的根茎提取物一直作为泻下药被广泛地使用。尤其是在国内,大黄作为药典收录的常用传统中药,有着较为重要的地位。大黄的根茎提取物最显著也是研究最多的药理作用为泻下作用,作为药物的多种大黄均有明显的泻下作用[2]。以药典收录的掌叶大黄R. palmatum为例,0.6 g・kg-1的掌叶大黄提取物可以降低小鼠的排便潜伏期、增加小鼠6 h排便量[3]。近年来随着对大黄的进一步研究,人们发现大黄属植物的提取物具有抗凝[4]、抗炎[5]、抗慢性肾衰竭[6]等多种作用。

  研究发现大黄提取物中的蒽醌类化合物可以起到调节肠道蠕动和导致腹泻的作用。在对多种大黄的药物分析实验中发现,5种蒽醌衍生物及其葡糖苷为普遍存在的成分[7](图1)。药典中对大黄含量测定和质量控制的规定中,选取的也是这5种化合物[1]。

  尽管这些化合物在大黄属的不同种植物中广泛存在,但是却不是所有含有蒽醌类化合物的大黄均有泻下作用。有文献报道尽管同属大黄属的华北大黄等植物的总蒽醌含量与掌叶大黄相近,但是其提取物促进腹泻的效果不明显甚至无效。早在20世纪40年代就有文献报道,与相应蒽醌苷相比,大黄提取物中的游离蒽醌类化合物口服时促进腹泻的活性很弱[8]。对于经不同炮制方法处理的大黄的药理研究也表明,当炮制处理导致结合型蒽醌降低而游离型蒽醌增加时,其导致腹泻的作用会明显减弱。这些实验均说明,经口服方式给药时,起到腹泻作用的成分应主要是蒽醌苷而非游离蒽醌。

  然而,将游离蒽醌直接注入大鼠结肠可导致水分重吸收被抑制[9]。类似的结果也在小鼠的实验中得到[10]。这些实验结果表明,游离蒽醌可以直接作用于大肠而导致腹泻。这似乎与口服给药的结果相矛盾,但这一问题在药物代谢方面的研究中得到了很好地解释。对于大黄蒽醌类化合物在人和大鼠体内的吸收和代谢的研究表明,经口服给药后的游离蒽醌类化合物可以较为快速地被小肠吸收,而到达大肠的蒽醌类化合物的量十分有限[11-13],因此其剂量不足以导致腹泻。而蒽醌苷类成分难以被小肠吸收,从而有较大的量到达大肠。在大肠中,蒽醌苷会因为细菌的代谢作用而脱掉糖,使蒽醌游离出来,从而作用于大肠,导致腹泻。在给药的同时给氯霉素的实验以及对无菌大鼠给药的实验中,蒽醌苷类均无法导致腹泻[14],这一实验结果很好地支持了这种观点。

  综上所述,在大黄提取物中,口服给药导致腹泻的有效成分为蒽醌苷类,这种化合物并非直接被吸收产生作用,而是在大肠中经过细菌的代谢转化为游离蒽醌,后者刺激大肠产生泻下药效。

  1.2 游离型蒽醌与肠平滑肌β肾上腺素受体的关系 消化道平滑肌受到肠道内神经丛和自主神经2个系统支配,自主神经主要包括起抑制作用的交感神经和起兴奋作用的副交感神经。目前发现的肾上腺素能受体有5种,分别为α1型肾上腺素受体、α2型肾上腺素受体、β1型肾上腺素受体、β2型肾上腺素受体和β3型肾上腺素受体。肾上腺素受体为典型的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR),为一种膜蛋白,结构上最大的特点为跨膜结构含有7个排列成筒状的α螺旋组成的7次跨膜域,肾上腺素的结合位点即在7次跨膜域中部[15] 。肠道上有多个亚型的肾上腺素受体分布,但是具体哪一种受体参与到了交感神经对肠道的抑制作用有一定的争议。多篇文献报道,用特异性抑制剂在豚鼠回肠进行实验,结果显示β1受体的激活可以导致肠平滑肌的抑制[16-17]。也有文献对此观点提出了质疑并认为有某些非典型的肾上腺素受体参与了这一过程[18]。一般认为,参与肠平滑肌抑制的受体为β2型肾上腺素受体[19]。不过无论哪种亚型的受体参与反应,公认的一点是β肾上腺素确实可以抑制肠平滑肌的收缩。由于肠道平滑肌活性水平是一种副交感神经的正向调节与交感神经的负向调节的平衡,M受体的竞争性抑制剂(例如阿托品)可以通过拮抗其中一种作用而打破这种平衡,从而达到对肠道的促进或抑制。经过分子对接实验计算结果表明,大黄蒽醌类成分对β肾上腺素受体有高度的亲和力,这种亲和力的结合位点与β肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔(propranolol)高度重合。提示这些成分可以直接作用于肾上腺素受体,起到相应的药理作用(图2)。随后作者通过体外肠肌实验进行了验证。结果表明,大黄中的主要游离型蒽醌成分之一的大黄素可以阻断肾上腺素所引起的小肠平滑肌的收缩抑制,而这一点与β2型肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔所表现出来的结果一致。由此证明了大黄蒽醌类成分主要通过阻断β2型肾上腺素受体从而促进了肠平滑蠕动,最终产生泻下的效应[20]。有报道大黄素可以促进结肠平滑肌的收缩,此结果与笔者的实验结果可以印证[21]。早期的研究报道表明大黄提取液低浓度可以增强离体大鼠的心率及心肌收缩力,高浓度时则心脏抑制,并通过静脉给药在猫身上得到验证[22]。而这一低浓度的兴奋,高浓度的抑制效应也在十二指肠平滑肌实验中得到进一步的印证[23]。但不管如何,大黄素作用于β2肾上腺素受体这一结果是确证的。   2 从化学角度比较认识大黄与土大黄

  作者研究发现,同属大黄属的华北大黄R. franzenbachii与以掌叶大黄R. palmatum为代表的正品大黄的药效有较大差异。口服给药时,掌叶大黄提取物可以有效地导致腹泻,而相同剂量华北大黄提取物则不能导致腹泻。但是,值得注意的是,华北大黄却有促进小鼠小肠推进的药效[3]。如前所述,葡萄糖部分在蒽醌苷中属于决定其吸收部位的“药动团”,而蒽醌苷元为药效团。所以如果游离的蒽醌类化合物含量较高而葡萄糖苷型的蒽醌衍生物含量较低时,蒽醌会在小肠被吸收故而可能作用于小肠。因此华北大黄的药效提示,游离型的苷元可能对小肠和大肠均有刺激作用。另外,通过分析可见,两药在大黄酸的含量上存在着较大的差异。无论是水解前还是水解后,正品大黄中的大黄酸含量都远高于华北大黄。己知大黄酸具有抗炎等多种药理作用[24],这些是否对两药的互通使用产生影响,值得进一步考察。

  为了验证蒽醌类化合物的这一作用,采用《中国药典》(2010年版)中关于大黄提取物含量测定的方法,用稀盐酸水解方法来破坏糖苷键,增加游离蒽醌含量,再在整体动物实验中对比水解前后的泻下的药效。同时由于之前研究表明,腹泻的主要原因是大肠刺激。故在这里将水样稀便的出现作为研究对大肠的刺激的指标,而将5 min肠推进百分比作为研究对小肠的刺激的指标。经过水解后,正品大黄和华北大黄的提取物中5种游离蒽醌的含量均有不同程度的增加(图3)。正品大黄总蒽醌含量增加了约2倍。这说明水解有效地破坏了糖苷键,使得蒽醌苷脱糖转化为游离苷元。小肠推进率结果表明,水解后的正品大黄提取物与对照组相比可以明显地增加小肠推进率。这一结果表明,当由于水解而造成游离蒽醌含量增加时,大黄提取物可以加快小肠蠕动。这提示促进小肠蠕动这一药效很可能与提取物中游离蒽醌的含量相关。在给药后的4 h时间内,给正品大黄提取物的12只小鼠中有9只出现了稀便,而对照组和水解后的提取物组均没有出现排稀便的情况。这表明,未经处理的大黄提取物口服给药时能有效地促进腹泻,而经过水解处理之后的提取物不能导致腹泻。而如前所述,这一结果在一定程度上反映出,当水解破坏了蒽醌苷的糖苷键时,大黄提取物对于大肠的刺激便消失了。

  结合3个实验来看,含结合型蒽醌较多,游离蒽醌较少的未水解的大黄提取物主要作用部分在大肠,作用结果为导致腹泻;而含游离蒽醌较多的水解后的大黄提取物主要作用部分在小肠,可以刺激小肠使之蠕动加快。正品大黄和华北大黄主要5个成分的糖苷结合率各不相同(表1),总体来说,正品大黄的结合率要高于华北大黄。正品大黄总糖苷结合率为51.36%,华北大黄总糖苷结合率为37.24%。也就是说,华北大黄的游离型蒽醌要多于正品大黄。由于游离型蒽醌能够作为配体、通过作用于肾上腺素受体,进而刺激肠平滑肌收缩。因此,华北大黄则主要作用于小肠平滑肌,而正品大黄则通过更多的结合型蒽醌类成分通过大肠菌的代谢脱糖、释放出游离型蒽醌进而刺激大肠平滑肌收缩。又由于泻下主要与大肠收缩有关。如此,华北大黄的游离性蒽醌高比例同时侧重作用于小肠、正品大黄的结合型蒽醌高比例同时侧重作用于大肠的特点,较好的解释了正品大黄泻下作用强,而华北大黄泻下作用弱的现象。为了更好的说明游离型蒽醌的这种受体阻断效应,作者选用了大黄素(emodin)为代表化合物进行了体外肠肌实验。结果表明,与水解后的掌叶大黄提取物相同,大黄素对于肾上腺素引起的小肠蠕动抑制同样有明显的拮抗作用[20]。类似的结果,在国内的一篇报道中也得到了印证[23]。

  以上实验说明,水解后含丰富游离蒽醌的大黄提取物的确可以作为肾上腺素的拮抗剂加快小肠蠕动。这表明,大黄蒽醌类化合物的作用机制为通过拮抗肾上腺素的作用、打破交感和副交感神经对于肠道调节的平衡,从而达到促进肠平滑肌收缩,加快肠蠕动的药效(图4)。而正品大黄和华北大黄泻下作用的差异的根本原因在于两者所含结合型蒽醌比例的多少、以及到达结肠的结合性蒽醌量的多少。因此,从泻下角度比较,华北大黄作用弱于正品大黄。

  3 大黄与土大黄的毒性比较

  小鼠灌胃正品大黄和华北大黄提取物,其LD50分别为15.078,9.865 g・kg-1[3]。从中可见华北大黄的毒性明显强于大黄。以2种大黄按不同比例做组合观察小鼠LD50的变化,结果表明,这种组合的LD50随着华北大黄的构成比例的增加而减小(R=-0.653)。由于LD50的剂量与毒性呈负相关,表明华北大黄的毒性要明显强于正品大黄。对于华北大黄的特征性成分土大黄苷(rhaponitin)[25]做LD50观察,尾静脉注射172 mg・kg-1未出现小鼠死亡,表明其毒性较小。提示华北大黄的毒性主要不在土大黄苷。将2种大黄提取物分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取,体外进行人源肝HepG2细胞毒性测定(MTT法,图5)。结果表明,其中氯仿和石油醚部分的毒性较强,50 mg・L-1表现出明显的细胞毒 性。乙酸乙酯部分则在100 mg・L-1时表现出明显的细胞毒性。尽管石油醚和乙酸乙酯部分具有细胞毒性,但是正品大黄和华北大黄之间却没有明显的差异。值得注意的是,氯仿部分正品大黄在100 mg・L-1表现出明显的细胞毒性,而华北大黄则在50 mg・L-1时即表现出明显的细胞毒性。两者差异非常明显(P<0.01)。提示两者的毒性的确有所不同,而这种毒性成分可能存在于氯仿萃取部分。结合小鼠LD50实验结果,可以确证,华北大黄的毒性强于正品大黄。因此,从毒性角度看,华北大黄不易直接替代正品大黄使用。

  4 小结

  综上可见,大黄与华北大黄从主要成分来看基本相同,所差异的是游离型和结合型蒽醌类成分,即大黄结合型蒽醌较多于华北大黄。由于游离型蒽醌类成分是直接作用于肠平滑肌β肾上腺素受体的配体成分,因此也就表现出了华北大黄在小肠时便对肠平滑的刺激作用,从而出现了小肠推进率高于大黄。而大黄的结合型蒽醌类成分经结肠菌代谢后脱糖,释放出游离型蒽醌类成分,从而作用于结肠平滑肌β肾上腺素受体,故主要表现在促进结肠蠕动的特点。这也就是一般认为的大黄通过刺激大肠而产生泻下作用的主要原理。从这一点来看,两者具有一定的互补作用,且可以联合使用。但是从毒性角度来分析,大黄的用量是华北大黄1.5倍左右(LD50 15.078/9.865 g・kg-1),毒性要明显小于华北大黄。鉴于此,华北大黄不易直接替代正品大黄使用,而宜单独建立相应的标准使用。