HPLC法测定大黄提取物中5种蒽醌的含量

  目的:采取HPLC 法测量评定中药材大黄中5 种蒽醌(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)的含量。方法:采用依利特ODS2 C18、柱(200mm×4.6mm,5μm),流动相为无水甲醇- 浓度0.1% 磷酸(75:25,V/V),流速为1ml/min,检测波长为255nm,柱温26℃。结果:芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸的回归方程如下:Y=1.97X-0.35, 相关系数R=0.99993;Y=0.98X-0.21, 相关系数R=0.99996;Y=1.26X-0.16, 相关系数R=0.99994;Y= 2.35X +0.17,相关系数R=0.99992;Y=1.93X+0.08,相关系数R=0.99992;5 种蒽醌的回收率如下:99.49%,97.37%,99.21%,98.84% 和98.74%。结论:用HPLC 法测定大黄提取物中5 种蒽醌的含量不仅简单快捷,而且具有准确性高、重现性好的特点,可以用于推广。

 

大黄提取物原材

  【关键词】HPLC 法;芦荟大黄素;大黄素甲醚;大黄酚;大黄素;大黄酸

  目前对大黄的研究已较为深入,然而以HPLC 法对大黄蒽醌含量的测定仍然欠缺研究,因此开展本研究,希望提供参考。

  1 研究材料

  大黄样品采用自成都市大黄中药材培植基地所产的掌叶大黄。实验仪器为Ultimate3000 高效液相色谱仪、赛多利斯BT125D 电子天平及KQ-250D 型超声波清洗器。主要试剂方面,芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸5 中对照品及磷酸、分析甲醇、色谱甲醇等均来自市场购买,去离子水由研究者自制。

  2 研究方法

  2.1 色谱条件

  255nm 的检测波长;1ml/min 的流速;柱温26℃;色谱柱采用依利特ODS2C18、柱(200 mm x4.6 mm,5μm)。

  2.2 自制溶液对照品

  取适量大黄对照品,应用无水甲醇,分别配置5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)的对照品溶液,采用浓度20、10、20、20、和20μg/ml 。

  2.3 自制供试品

  精确称量取用大黄中药材0.500g,放置在25ml 的容量瓶内,分别添加无水甲醇20ml 和超声波提取35min,待溶液冷却至接近室内温度,加入无水甲醇,定容到刻度,使震荡溶解,用0.20μm 滤膜过滤。

  2.4 方法学考察

  2.4.1 线性关系考察

  依据前文所述色谱条件,取用对照品溶液,精密吸取2、5、10、20、40μL,并分别进行进样测定,以浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,进行回归分析,得到5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)的线性回归方程。

  2.4.2 精密度考察

  依据前文所述色谱条件,吸取对照品的混合溶液,5 次连续进样,计算5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)峰面积下的RSD。

  2.4.3 稳定性考察

  各吸供试品溶液,间隔2h 进行一次测定,得到供试品溶液中5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)峰面积下的RSD。

  2.4.4 重复性考察

  取大黄样品精密称取5 份,按照供试品的制备方法,制作溶液用于方法测定,依结果计算5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)的保留时间以及峰面积下的RSD。

  2.4.5 回收率考察

  大黄样品已知含量,精密称取0.500g,共取三份,每一份中加入相同含量的对照品,按照供试品制备方法处理,得出平均回收率及RSD。

  2.5 大黄含量测定

  按照供试品制备方法,制得大黄样品溶液后进样20μl,在255nm 处,检测样品各成分所对应峰面积,根据所计算的线性回归方程,得出5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)含量。

  3 结果

  3.1 方法学考察结果

  (1)线性关系考察。计算得出大黄样品中5 种蒽醌成分(芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和大黄酸)的线性回归方程,发现5 种蒽醌成分均呈良好线性关系。具体结果见表1。

  (2)精密度考察。计算得出大黄样品中5 种蒽醌成分精密度良好,RSD 分别是0.55%、1.25%、1.87%、1.08% 和1.61%;

  (3)稳定性考察。计算得出大黄样品中5种蒽醌成分稳定性良好,在12 个小时内保持稳定。RSD 分别是1.91%、1.30%、1.42%、1.54%、1.51%(n=7);(4)重复性考察。计算得出大黄样品中5 种蒽醌成分重复性较好,在保留时间上的RSD 分别是0.72%、2.04%、1.09%、1.74%、1.63%,在峰面积上的RSD 分别是1.44%、1.82%、1.91%、0.74%、1.06%;(5)回收率考察。计算得出大黄样品中5 种蒽醌成分回收率分别是99. 49% ,97. 37% ,99. 21% ,98. 84%、98.74%,其RSD 分别是0.41%、1.47%、0.55%、1.32%、0.84%;方法学考察结果说明,用HPLC 法测定大黄提取物中5 种蒽醌的含量不仅简单快捷,而且准确性高、重现性好。

  3.2 含量测定结果

  成都产掌叶大黄的5 种蒽醌成分分别如下:芦荟大黄素0.076%;大黄素甲醚0.145%;大黄酚0.823%;大黄素0.187%;大黄酸0.113%。

  4 结论

  本研究通过使用HPLC 法,对大黄药材中5 种游离蒽醌含量进行测定,确定了这种方法简单快速、准确性高、重现性好,可用于大黄药材质量评定。

  参考文献

  [1] 颜永刚, 尹立敏, 王红艳等.HPLC法同时测定大黄炮制品中10 种化学成分的含量[J]. 中国药房,2016,27(27):3839-3842.

  [2] 毛春芳, 施忠, 罗琳等.HPLC 法同时测定大黄中芦荟大黄素等11 种成分的量[J]. 中草药,2014,45(16):2400-2403.

  作者简介

  卓俊睿(1991-),女,贵州省遵义市人。遵义医药高等专科学校助教。硕士学位。专业为药物化学, 主要研究方向为生物催化与手性合成。